Plasmide CRISPR d'Activation (h) AMBP: sc-403136-ACT

L’AMBP humain code le précurseur de l’alpha-1-microglobuline/bikunin, une glycoprotéine sécrétée qui est traitée par protéolyse pour générer l’alpha-1-microglobuline et le bikunin. L’alpha-1-microglobuline est impliquée dans la fixation de l’hème et dans la défense extracellulaire associée aux réactions d’oxydoréduction, contribuant au contrôle du stress oxydatif et des lésions tissulaires inflammatoires, tandis que le bikunin agit comme un inhibiteur de sérine protéase de type Kunitz qui module la protéolyse péricellulaire. Par ces activités, AMBP s’inscrit à l’interface de voies impliquées dans le remodelage de la matrice extracellulaire, les cascades de protéases liées à la coagulation et l’inflammation. Une expression ou un traitement d’AMBP dérégulés ont été associés à la physiopathologie rénale et hépatique, à des états inflammatoires systémiques et au remodelage du microenvironnement tumoral, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de la protéostasie et des réponses aux dommages tissulaires.

AMBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AMBP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AMBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AMBP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AMBP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AMBP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AMBP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AMBP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AMBP dans les cellules tumorales présentant une expression de AMBP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.