AMBP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403136-ACT

L’AMBP umano codifica il precursore dell’alfa-1-microglobulina/bikunina, una glicoproteina secreta che viene processata proteoliticamente per generare alfa-1-microglobulina e bikunina. L’alfa-1-microglobulina è implicata nel legame dell’eme e nella difesa extracellulare associata ai processi redox, contribuendo al controllo dello stress ossidativo e del danno tissutale infiammatorio, mentre la bikunina funziona come inibitore delle serin-proteasi di tipo Kunitz che modula la proteolisi pericellulare. Attraverso queste attività, AMBP si interseca con vie che regolano il rimodellamento della matrice extracellulare, le cascate di proteasi legate alla coagulazione e l’infiammazione. Un’espressione o un processamento deregolati di AMBP sono stati associati alla fisiopatologia renale ed epatica, a stati infiammatori sistemici e al rimodellamento del microambiente tumorale, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sulla proteostasi e sulle risposte al danno tissutale.

AMBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AMBP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AMBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AMBP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AMBP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AMBP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AMBP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AMBP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AMBP nelle cellule tumorali con espressione di AMBP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.