Plasmide CRISPR d'Activation (m) ALKBH8: sc-426676-ACT

Chez la souris, Alkbh8 code ALKBH8, une enzyme de modification des ARNt qui soutient la fidélité de la traduction en catalysant des étapes clés de la chimie de l’uridine « wobble », notamment des méthylations et des modifications oxydatives qui influencent le décodage des codons. En régulant l’efficacité du décodage dépendant des ARNt, ALKBH8 affecte l’homéostasie protéique et les voies d’adaptation au stress cellulaire, en particulier dans des conditions oxydatives et génotoxiques. Des altérations de l’activité d’ALKBH8 ont été associées à un dérèglement du paysage des modifications de l’ARN, susceptible d’influencer la stabilité du génome, la signalisation de réponse au stress et des programmes de survie cellulaire pertinents pour la biologie du cancer et des modèles de lésions tissulaires inflammatoires. En tant que nœud du contrôle épitranscriptomique de la traduction, Alkbh8 est fréquemment étudié dans le contexte de l’équilibre rédox, des réponses aux dommages de l’ADN et de phénotypes liés à la protéostasie.

ALKBH8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Alkbh8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ALKBH8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Alkbh8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Alkbh8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ALKBH8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Alkbh8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ALKBH8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ALKBH8 dans les cellules tumorales présentant une expression de Alkbh8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.