Akt2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400060-ACT

AKT2 codifica la chinasi serina/treonina Akt2, un effettore centrale della segnalazione dipendente da PI3K che collega la stimolazione da fattori di crescita al metabolismo, alla sopravvivenza e alla proliferazione cellulare. Akt2 fosforila substrati che regolano l’assorbimento di glucosio, la sintesi di glicogeno, il metabolismo lipidico e la progressione del ciclo cellulare, con ruoli di primo piano nella segnalazione insulinica e nel controllo della via mTOR. Nella biologia umana, un’alterata attività di AKT2 è stata associata a una disregolazione dell’omeostasi metabolica e a circuiti di segnalazione oncogenica che plasmano la crescita cellulare e la resistenza allo stress. In quanto nodo di via che integra gli input dei recettori tirosin-chinasici con programmi trascrizionali e metabolici a valle, AKT2 è ampiamente studiato in modelli di insulino-resistenza, biologia degli adipociti e segnalazione delle cellule tumorali.

Akt2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AKT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Akt2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AKT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AKT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Akt2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AKT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Akt2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Akt2 nelle cellule tumorali con espressione di AKT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.