Plasmide CRISPR d'Activation (h) AKR1D1: sc-404897-ACT

AKR1D1 code la 5β-réductase des stéroïdes, une aldo-céto réductase qui catalyse une étape essentielle de la biosynthèse des acides biliaires en convertissant les Δ4-3-cétostéroïdes en intermédiaires 5β-réduits. Cette activité soutient le catabolisme hépatique du cholestérol, l’homéostasie des acides biliaires et la signalisation métabolique en aval via des récepteurs nucléaires sensibles aux acides biliaires, tels que FXR, reliant ainsi AKR1D1 à des voies plus larges de régulation des lipides et du glucose. Une expression ou une fonction altérée d’AKR1D1 peut perturber la composition des acides biliaires et le métabolisme des stéroïdes, avec des implications pour des phénotypes cholestatiques et la dysfonction métabolique hépatique. En tant qu’enzyme enrichie dans le foie, AKR1D1 est fréquemment étudiée dans des modèles d’hépatocytes afin de déterminer comment le flux d’acides biliaires et l’élimination des stéroïdes influencent les réponses au stress inflammatoire et métabolique.

AKR1D1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AKR1D1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AKR1D1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AKR1D1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AKR1D1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AKR1D1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AKR1D1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AKR1D1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AKR1D1 dans les cellules tumorales présentant une expression de AKR1D1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.