Plasmide CRISPR d'Activation (h) AKAP 79: sc-402647-ACT

AKAP5 humain code la protéine d’ancrage de l’A-kinase 79 (AKAP 79), une protéine d’échafaudage associée à la membrane qui organise spatialement la PKA avec des enzymes clés de signalisation, notamment PP2B/calcineurine et la PKC, afin de moduler la phosphorylation en fonction des stimuli. En arrimant ces complexes à proximité des récepteurs et des canaux ioniques, AKAP 79 régule une signalisation compartimentée dépendante de l’AMPc et du Ca2+, la plasticité synaptique et le remodelage des synapses excitatrices dépendant de l’activité. La signalisation associée à AKAP 79 influence le fonctionnement des récepteurs AMPA et NMDA ainsi que des programmes transcriptionnels en aval qui contrôlent l’excitabilité neuronale. Une dérégulation des plateformes de signalisation liées à AKAP5 a été impliquée dans des mécanismes de maladies neurologiques et psychiatriques, où des altérations de la signalisation synaptique et de l’équilibre des voies Ca2+/AMPc contribuent à la physiopathologie.

AKAP 79 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AKAP5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AKAP 79 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AKAP5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AKAP5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AKAP 79. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AKAP5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AKAP 79 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AKAP 79 dans les cellules tumorales présentant une expression de AKAP5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.