AK2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419063-ACT

Maus Ak2 kodiert die Adenylatkinase 2 (AK2), eine Phosphotransferase im Intermembranraum der Mitochondrien, die die Homöostase der Adeninnukleotide aufrechterhält, indem sie die reversible Phosphatübertragung zwischen AMP, ADP und ATP katalysiert. Durch die Regulation des zellulären Energiehaushalts und der mitochondrialen Funktion beeinflusst AK2 Prozesse, die mit der oxidativen Phosphorylierung, metabolischen Stressantworten und apoptotischer Signalübertragung verknüpft sind. Störungen der AK2-Aktivität wurden mit Defekten in der hämatopoetischen Entwicklung und der Homöostase von Immunzellen in Verbindung gebracht, wodurch Ak2 ein relevantes Ziel für die Untersuchung mitochondriengekoppelter Mechanismen ist, die die Gewebeentwicklung und inflammatorische Phänotypen beeinflussen. In Mausmodellsystemen wird AK2 häufig im Kontext des mitochondrialen Stoffwechsels, der Nukleotiddynamik und energieabhängiger Signalnetzwerke untersucht.

AK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ak2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ak2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ak2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AK2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ak2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AK2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AK2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ak2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.