AHCYL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417109-ACT

L’AHCYL1 umano codifica l’adenosilomocisteinasi-like 1, un paralogo non catalitico dell’idrolasi della S-adenosilomocisteina che funge da componente regolatoria, collegando la capacità di transmethylazione alla segnalazione intracellulare. AHCYL1 è stato implicato nella modulazione delle dinamiche del calcio dipendenti dal recettore dell’inositolo 1,4,5-trisfosfato e di programmi associati quali la segnalazione correlata al reticolo endoplasmatico, l’adattamento metabolico e le risposte allo stress. Attraverso queste connessioni, l’espressione di AHCYL1 può influenzare gli output epigenetici e trascrizionali a valle delle vie dipendenti dalla metilazione e sensibili al Ca²⁺. La disregolazione dell’equilibrio della metilazione e della segnalazione del Ca²⁺ è frequentemente osservata in contesti infiammatori, neurobiologici e oncogeni, rendendo AHCYL1 un nodo utile per indagini meccanicistiche in modelli cellulari rilevanti per la malattia.

AHCYL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AHCYL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AHCYL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AHCYL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AHCYL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AHCYL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AHCYL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AHCYL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AHCYL1 nelle cellule tumorali con espressione di AHCYL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.