AF-6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-404503-ACT-2

O AFDN humano codifica a proteína de andaime juncional AF-6 (afadina), um adaptador multidomínio que conecta receptores de adesão da família das nectinas ao citoesqueleto de actina para organizar as junções aderentes e manter a integridade da barreira epitelial e endotelial. A AF-6 coordena a remodelação do citoesqueleto e a polaridade celular ao integrar sinais de pequenas GTPases como Rap1 e Ras, contribuindo para a formação de contactos, a migração coletiva e a mecanotransdução na morfogénese dos tecidos. A desregulação da função e da localização de AFDN/AF-6 tem sido associada a alterações na adesão célula–célula e a comportamento invasivo no cancro, e variantes que afetam a estabilidade juncional têm sido implicadas em fenótipos do neurodesenvolvimento e vasculares. Assim, o AFDN é amplamente utilizado em estudos de edição genética e de genómica funcional para investigar a montagem de junções, redes de polaridade e o crosstalk de sinalização em contactos célula–célula em modelos celulares humanos.

AF-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AFDN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AF-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AFDN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AFDN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AF-6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AFDN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AF-6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AF-6 em células tumorais com expressão de AFDN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.