Plasmide CRISPR d'Activation (h) Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8: sc-402004-ACT

L’ADCY8 humain code l’adénylate cyclase 8 (AC8), une adénylyl cyclase membranaire stimulée par le calcium/la calmoduline qui catalyse la conversion de l’ATP en AMPc, un second messager central contrôlant les voies PKA, EPAC et celles dépendantes des canaux activés par les nucléotides cycliques. En couplant la dynamique intracellulaire du Ca2+ à la production d’AMPc, AC8 module des réponses dépendantes des GPCR et de l’activité, qui régulent l’excitabilité neuronale, la plasticité synaptique et les processus stimulus–sécrétion. L’activité d’ADCY8 s’intègre aux programmes transcriptionnels dépendants de CREB ainsi qu’aux rétrocontrôles exercés par les phosphodiestérases, afin d’ajuster l’amplitude et la durée du signal. Des études génétiques et fonctionnelles impliquent une dérégulation de l’AMPc liée à ADCY8 dans des phénotypes neuropsychiatriques et cognitifs, étayant des recherches mécanistiques sur l’apprentissage, la mémoire et la signalisation à l’échelle des circuits.

Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADCY8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADCY8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADCY8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADCY8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 dans les cellules tumorales présentant une expression de ADCY8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.