Plasmide CRISPR d'Activation (m) Adenylate cyclase 10/ADCY10: sc-435448-ACT

Adcy10 code l’adénylate cyclase 10 (ADCY10), une adénylyl cyclase « soluble » atypique, régulée par le bicarbonate et Ca2+, qui génère de l’AMPc indépendamment de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G. En contrôlant la production locale d’AMPc, ADCY10 module des voies de signalisation dépendantes de PKA et d’EPAC, influençant des réseaux de phosphorylation, le transport ionique et des programmes transcriptionnels tels que la régulation génique médiée par l’élément de réponse à l’AMPc (CRE). Dans les systèmes murins, l’activité d’Adcy10 est souvent étudiée dans le contexte de la détection intracellulaire du pH/CO2, des microdomaines d’AMPc métaboliques et mitochondriaux, et des interactions de signalisation avec la dynamique du calcium. Une signalisation AMPc dérégulée est largement impliquée dans des perturbations de l’homéostasie cellulaire et des phénotypes dépendants de la signalisation, ce qui justifie l’utilisation d’Adcy10 comme nœud mécanistique dans des modèles de maladie axés sur les voies, sans pour autant impliquer de résultats cliniques.

Adenylate cyclase 10/ADCY10 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Adcy10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Adenylate cyclase 10/ADCY10 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Adcy10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Adcy10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Adenylate cyclase 10/ADCY10. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Adcy10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Adenylate cyclase 10/ADCY10 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Adenylate cyclase 10/ADCY10 dans les cellules tumorales présentant une expression de Adcy10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.