Plasmide CRISPR d'Activation (h) adenosine deaminase: sc-402201-ACT

L’ADA humaine code l’adénosine désaminase, une enzyme de la voie de sauvetage des purines qui désamine de manière irréversible l’adénosine et la désoxyadénosine en inosine et désoxyinosine, modulant ainsi les pools de purines intracellulaires et extracellulaires. En contrôlant les niveaux de nucléosides immunomodulateurs, l’ADA influence le métabolisme des nucléotides, le développement des lymphocytes et une homéostasie cellulaire plus large liée à la réplication de l’ADN et aux réponses au stress. Une activité de l’ADA dérégulée perturbe l’équilibre et la signalisation des purines, et l’ADA est largement étudiée dans des contextes où la fonction des cellules immunitaires et le remodelage métabolique se recoupent. Cela fait de l’ADA un point d’entrée utile pour explorer le dialogue entre métabolisme des purines et immunité, ainsi que la régulation des programmes d’expression génique induite par les nucléosides.

adenosine deaminase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

adenosine deaminase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de adenosine deaminase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de adenosine deaminase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie adenosine deaminase dans les cellules tumorales présentant une expression de ADA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.