Plasmide CRISPR d'Activation (h) ADAR3: sc-402742-ACT

ADARB2 code pour ADAR3, une adénosine désaminase agissant sur l’ARN enrichie dans les neurones, qui se lie à l’ARN double brin et est associée à la régulation de la dynamique de l’édition de l’ARN dans le système nerveux. Dans le cadre de la régulation post‑transcriptionnelle des gènes, l’édition A‑vers‑I de l’ARN influence la stabilité des transcrits, l’épissage alternatif, le ciblage par les miARN et le potentiel codant, façonnant ainsi la signalisation synaptique et l’excitabilité neuronale. Bien qu’ADAR3 soit généralement considérée comme ayant une activité catalytique limitée par rapport à ADAR1/ADAR2, elle peut moduler l’accès aux substrats ARN et est étudiée dans le contexte de la biologie des maladies neurodéveloppementales et neuropsychiatriques. Des paysages d’édition de l’ARN dérégulés, associés à l’activité de la famille ADAR, ont été rapportés dans diverses affections neurologiques et tumeurs cérébrales, ce qui motive des études mécanistiques de la régulation de l’ARN dépendante d’ADAR3 dans des cellules humaines.

ADAR3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADARB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ADAR3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADARB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADARB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ADAR3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADARB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ADAR3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ADAR3 dans les cellules tumorales présentant une expression de ADARB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.