ADAMTS-5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402695-ACT

ADAMTS5 kodiert ADAMTS-5, eine sekretierte, zinkabhängige Metalloproteinase, die Proteoglykane der extrazellulären Matrix spaltet, insbesondere Aggrecan und Versican, und dadurch den Matrixumsatz sowie das Gewebe-Remodeling reguliert. Die Aktivität von ADAMTS-5 beeinflusst die Knorpelhomöostase, die Zusammensetzung der perizellulären Matrix und Zell‑Matrix‑Signalereignisse, die mit Entzündungsmediatoren und der Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren zusammenhängen. Eine fehlregulierte ADAMTS5-Expression oder proteolytische Aktivität wurde mit einem beschleunigten Abbau der extrazellulären Matrix bei degenerativen Gelenkprozessen und allgemeineren Pathologien des Bindegewebes in Verbindung gebracht. Als matrixmodifizierendes Enzym wird ADAMTS-5 häufig in Signalwegen untersucht, die den Knorpelkatabolismus, das stromale Remodeling und das Gleichgewicht zwischen Proteasen und Inhibitoren steuern.

ADAMTS-5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADAMTS5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADAMTS-5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADAMTS5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADAMTS5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADAMTS-5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADAMTS5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADAMTS-5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADAMTS-5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADAMTS5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.