Plasmide CRISPR d'Activation (m) ACTA2: sc-418973-ACT

Acta2 code l’actine alpha des muscles lisses (ACTA2), un composant central de l’appareil contractile des cellules musculaires lisses vasculaires, des myofibroblastes et d’autres lignées mésenchymateuses. ACTA2 polymérise en filaments d’actine qui coordonnent l’organisation du cytosquelette, l’adhésion cellulaire et la génération de force lors de la migration, du remodelage tissulaire et de la réparation des plaies. Son expression est étroitement régulée par la mécanotransduction et les programmes de différenciation, notamment via la signalisation RhoA/ROCK et le contrôle transcriptionnel SRF–MRTF, et elle est fréquemment induite en aval de l’activation des myofibroblastes dépendante du TGF-β. L’activité et l’expression dérégulées d’ACTA2 sont largement utilisées comme indicateurs dans les études sur le remodelage vasculaire, la commutation phénotypique associée à la fibrose et la dysfonction des muscles lisses dans des modèles de maladies cardiopulmonaires et du tissu conjonctif.

ACTA2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Acta2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ACTA2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Acta2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Acta2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ACTA2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Acta2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ACTA2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ACTA2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Acta2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.