Plasmide CRISPR d'Activation (h) ACTA1: sc-400005-ACT

ACTA1 code l’α-actine du muscle squelettique, un composant essentiel des filaments fins qui polymérise en F-actine afin de soutenir l’assemblage du sarcomère, la génération de force et l’organisation du cytosquelette dans le muscle strié. Par ses interactions avec la myosine, la tropomyosine et le complexe troponine, ACTA1 s’intègre aux processus de contractilité actomyosine et de mécanotransduction qui façonnent la structure et la fonction des fibres musculaires. Les dynamiques de l’actine dépendantes d’ACTA1 influencent également l’architecture cellulaire et des voies de signalisation liées à la différenciation et au maintien musculaires. Une dérégulation ou des variations pathogènes d’ACTA1 sont associées à des myopathies squelettiques héréditaires caractérisées par une organisation filamentaire altérée et des performances contractiles modifiées.

ACTA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACTA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ACTA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACTA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACTA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ACTA1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACTA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ACTA1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ACTA1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ACTA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.