ABP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410674-ACT

Human AOC1 kodiert die kupferhaltige Aminoxidase 1 (auch als ABP1/DAO bekannt), ein sezerniertes und membranassoziiertes Enzym, das die oxidative Desaminierung biogener Amine wie Histamin und Putrescin katalysiert und dabei Aldehyde, Ammoniak und Wasserstoffperoxid erzeugt. Durch die Regulation des extrazellulären Aminspiegels sowie die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies beeinflusst AOC1 inflammatorische Signalwege, die Biologie der epithelialen Barriere und redoxsensitive Signalwege im Gewebemikromilieu. Eine veränderte AOC1-Aktivität oder -Expression wurde mit einer gestörten Histaminmetabolisierung und Immunantworten in Verbindung gebracht und in Zusammenhängen wie allergieassoziierter Entzündung, gastrointestinaler Schleimhautfunktion und tumorassoziierter Stromabiologie untersucht. Diese Eigenschaften machen AOC1 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zur Amin-Katabolisierung, zu oxidativem Stress und zur durch extrazelluläre Metabolite vermittelten Zell-Zell-Signalgebung.

ABP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AOC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ABP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AOC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AOC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ABP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AOC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ABP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ABP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AOC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.