Plasmide CRISPR d'Activation (h) ABP1: sc-410674-ACT

L’AOC1 humain code l’amine oxydase 1 contenant du cuivre (également appelée ABP1/DAO), une enzyme sécrétée et associée à la membrane qui catalyse la désamination oxydative d’amines biogènes telles que l’histamine et la putrescine, produisant des aldéhydes, de l’ammoniac et du peroxyde d’hydrogène. En régulant le niveau extracellulaire d’amines et la production d’espèces réactives de l’oxygène, AOC1 influence la signalisation inflammatoire, la biologie de la barrière épithéliale et les voies sensibles à l’état rédox dans le microenvironnement tissulaire. Des altérations de l’activité ou de l’expression d’AOC1 ont été associées à une dérégulation du métabolisme de l’histamine et des réponses immunitaires, et ont été étudiées dans des contextes incluant l’inflammation liée aux allergies, la fonction de la muqueuse gastro-intestinale et la biologie du stroma associé aux tumeurs. Ces propriétés font d’AOC1 une cible utile pour des études mécanistiques de la dégradation des amines, du stress oxydant et de la signalisation intercellulaire médiée par des métabolites extracellulaires.

ABP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AOC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ABP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AOC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AOC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ABP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AOC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ABP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ABP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de AOC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.