ABCA4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401830-ACT

ABCA4 codifica um transportador da família ATP-binding cassette (ABC) expresso predominantemente nos fotorreceptores da retina, onde se localiza nas membranas dos discos do segmento externo e atua no ciclo visual. ABCA4 medeia o transporte dependente de ATP de conjugados retinoides, ajudando a remover N-retinilideno-fosfatidiletanolamina e intermediários relacionados para limitar o acúmulo de bisretinoides citotóxicos, como o A2E. Por meio do seu papel no processamento de retinoides, ABCA4 sustenta a homeostase dos fotorreceptores e se conecta a vias que regulam o transporte de lipídios, o estresse oxidativo e as interações entre o epitélio pigmentar da retina e os fotorreceptores. A desregulação ou a atividade reduzida de ABCA4 está fortemente associada a degenerações retinianas hereditárias, incluindo a doença de Stargardt e a distrofia cone-bastonete relacionada ao ABCA4, tornando-o um alvo central para estudos mecanísticos da patobiologia da retina.

ABCA4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ABCA4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ABCA4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ABCA4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ABCA4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ABCA4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ABCA4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ABCA4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ABCA4 em células tumorais com expressão de ABCA4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.