A530016L24Rik CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m): sc-435689

Übersicht

A530016L24Rik kodiert ein vorhergesagtes Mausprotein mit nur begrenzter funktioneller Annotation und wurde bislang vor allem im Rahmen transkriptombasierter Kataloge nicht charakterisierter Loci untersucht. Verfügbare Expressionsdaten deuten auf eine kontextabhängige Regulation hin, was das Gen zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung von Gen-Netzwerken macht, die Zellzustandsübergänge, Differenzierung und gewebespezifische Programme steuern. Als unvollständig charakterisiertes Gen wird A530016L24Rik häufig genutzt, um übergeordnete Regulatoren und nachgeschaltete Effektoren zu kartieren, die auf zentrale Prozesse wie RNA-Metabolismus, Proteinhomöostase und stressadaptive Signalwege zusammenlaufen. Die Analyse seines Loss-of-Function-Phänotyps kann helfen, schlecht annotierte Genomregionen mit krankheitsrelevanten molekularen Signaturen in Verbindung zu bringen, die bei Entwicklungsstörungen und komplexen Merkmalen beobachtet werden, ohne dabei einen klinischen Nutzen zu implizieren.

A530016L24Rik CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des A530016L24Rik-Gens in mouse-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des A530016L24Rik-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das A530016L24Rik HDR-Plasmid (m) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte A530016L24Rik Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem A530016L24Rik CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das A530016L24Rik offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des A530016L24Rik-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf A530016L24Rik Exon(e) abzielt, die für die A530016L24Rik Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.