Plasmide CRISPR d'Activation (h) A20/TNFAIP3: sc-400447-ACT

TNFAIP3 code A20, une enzyme d’édition de l’ubiquitine à doigts de zinc qui agit comme un régulateur négatif central de la signalisation inflammatoire. A20 met fin à l’activation des voies NF-κB et MAPK en aval de récepteurs tels que TNFR, IL-1R et les TLR, en modulant les chaînes d’ubiquitine sur des intermédiaires clés de signalisation, limitant ainsi la production de cytokines et empêchant une activation immunitaire prolongée. En contrôlant la mort cellulaire et les réponses au stress, A20 contribue au maintien de l’homéostasie immunitaire dans de nombreux types cellulaires, notamment les lignées myéloïdes et lymphoïdes. Une expression ou une fonction dérégulée de TNFAIP3 a été associée à des pathologies d’origine immunitaire et à des mécanismes de maladies inflammatoires, ce qui en fait une cible largement utilisée pour étudier la rétroaction de signalisation, la biologie de l’ubiquitine et le dialogue entre immunité innée et adaptative.

A20/TNFAIP3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFAIP3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

A20/TNFAIP3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFAIP3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFAIP3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de A20/TNFAIP3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFAIP3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de A20/TNFAIP3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie A20/TNFAIP3 dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFAIP3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.