6CKine CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403041-ACT

Humanes CCL21 kodiert das Chemokin 6CKine, einen homöostatischen CCR7-Liganden, der dendritische Zellen und naive T‑Zellen in sekundäre lymphatische Organe leitet und die Organisation lymphatischen Gewebes unterstützt. Durch die Ausbildung chemotaktischer Gradienten reguliert CCL21 den Leukozytenverkehr, den Crosstalk zwischen lymphatischen Endothelzellen und Immunzellen sowie die Positionierung antigenpräsentierender Zellen während der Immunüberwachung. Diese Achse greift in GPCR-Signalgebung, zytoskelettales Remodeling und Adhäsionsprogramme ein, die Zellmigration und Kompartimentierung prägen. Eine fehlregulierte CCL21/CCR7-Signalgebung wird mit veränderter Rekrutierung entzündlicher Zellen und einer Umgestaltung des Immunmikromilieus in Zusammenhang gebracht, etwa bei chronischen Entzündungen und tumorassoziierter Lymphangiogenese, wodurch sie ein nützliches Ziel für mechanistische Studien in der Immunologie darstellt.

6CKine Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCL21-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

6CKine Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCL21-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCL21-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 6CKine-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCL21-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 6CKine-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 6CKine-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCL21-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.