4E-BP3 Plasmide KO CRISPR/Cas9 (h2): sc-406304-KO-2

Panoramica

EIF4EBP3 codifica 4E-BP3, un inibitore sensibile alla fosforilazione della traduzione dell’mRNA cap-dipendente che si lega a eIF4E e limita l’assemblaggio del complesso di inizio eIF4F. In quanto membro della famiglia 4E-BP, 4E-BP3 agisce a valle della segnalazione PI3K–AKT–mTOR, dove la fosforilazione mediata da mTORC1 allevia il sequestro di eIF4E aumentando la traduzione selettiva di trascritti coinvolti in crescita, risposta allo stress e metabolismo. Attraverso questo controllo dell’output traducibile, EIF4EBP3 contribuisce alla regolazione della proliferazione cellulare, dei programmi di sopravvivenza e dell’adattamento ai segnali di nutrienti ed energia. La deregolazione dell’asse mTOR–eIF4E e l’alterata attività delle 4E-BP sono spesso implicate nella segnalazione oncogenica e in altri disturbi caratterizzati da proteostasi aberrante e rimodellamento metabolico, il che motiva studi meccanicistici su EIF4EBP3 in questi contesti.

4E-BP3 Il plasmide CRISPR/Cas9 KO (h2) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene EIF4EBP3 in human linee cellulari. Ogni plasmide del pool co-esprime un sgRNA unico, mirato a un sito distinto all'interno del locus EIF4EBP3, insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes, e codifica per la GFP per consentire l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo. Questa strategia multi-guida aumenta la probabilità di indurre spostamenti di lettura o delezioni che producono un knockout funzionale, offrendo un'alternativa più robusta agli approcci a guida singola. Le DSB indotte in più siti vengono risolte tramite giunzione non omologa (NHEJ) o, se utilizzate con il modello donatore HDR incluso, tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) in un sito bersaglio definito all'interno del locus.

Se utilizzato in combinazione con il donatore HDR che esprime RFP, la fluorescenza GFP e RFP può essere utilizzata insieme per distinguere le popolazioni cellulari trasfettate da quelle modificate, semplificando i flussi di lavoro di selezione e selezione dei cloni basati sulla citometria a flusso.

Donatore per riparazione diretta dall'omologia (HDR) — Cassetta puromicina con reporter RFP

Per applicazioni che richiedono cloni knockout confermati e selezionabili, il 4E-BP3 Plasmide HDR (h2) include un costrutto donatore HDR contenente una cassetta di resistenza alla puromicina (PuroR) e un reporter proteina fluorescente rossa (RFP), affiancati da bracci di omologia specifici per un sito bersaglio definito EIF4EBP3.
Se cotrasfettato con il 4E-BP3 Plasmide CRISPR/Cas9 KO (h2):

• La cassetta PuroR-RFP si integra nel sito di taglio di Cas9 tramite HDR, interrompendo il frame di lettura aperto EIF4EBP3.
  La fluorescenza RFP fornisce un indicatore visivo immediato dell'integrazione riuscita, consentendo l'identificazione o la selezione basata sulla fluorescenza delle cellule modificate prima o parallelamente alla selezione con puromicina.
  Le cellule modificate con successo vengono confermate attraverso la resistenza alla puromicina, riducendo sostanzialmente il carico di screening dei cloni.
  Questa strategia di selezione è ideale per generare linee cellulari KO clonali stabili per studi funzionali a valle, screening farmacologico o sviluppo di modelli.

Sistema di rimozione della cassetta Cre-lox

Il costrutto donatore HDR presenta siti loxP che fiancheggiano la cassetta di selezione PuroR-RFP per consentire la rimozione pulita del marcatore dopo la conferma del clone. L'espressione transiente della ricombinasi Cre tramite il vettore Cre incluso : sc-418923 elimina la cassetta, lasciando un sito loxP residuo minimo all'interno del locus EIF4EBP3 ed eliminando potenziali effetti confondenti sui saggi a valle.
Questo approccio in due fasi:

• Riduce al minimo la perturbazione dell'architettura cromatinica locale e degli elementi regolatori adiacenti
  Ripristina un contesto genomico quasi nativo nel locus modificato
  Consente il riutilizzo della strategia di selezione con puromicina nella stessa linea cellulare per ulteriori modifiche

Caratteristiche principali

• gRNA mirato agli esoni EIF4EBP3 critici per la funzione 4E-BP3
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Donore HDR con resistenza alla puromicina per la selezione positiva dei cloni
  Cassetta PuroR fiancheggiata da loxP con vettore ricombinasi Cre per la rimozione senza soluzione di continuità del marcatore
  Fornito pronto all'uso per la somministrazione tramite trasfezione

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.