Plasmide CRISPR d'Activation (h) 4E-BP1: sc-400398-ACT

EIF4EBP1 code pour 4E-BP1, un répresseur de la traduction dépendante de la coiffe, sensible à la phosphorylation, qui se lie à EIF4E et limite l’assemblage du complexe eIF4F. En tant qu’effecteur clé en aval de la voie PI3K–AKT–mTOR, 4E-BP1 intègre des signaux issus des facteurs de croissance, des nutriments et du stress afin d’ajuster la synthèse protéique globale, la croissance cellulaire et l’adaptation métabolique. La phosphorylation de 4E-BP1 par mTORC1 libère EIF4E et favorise la traduction de transcrits impliqués dans la prolifération et la survie, reliant ainsi la régulation d’EIF4EBP1 à la protéostasie et au contrôle du cycle cellulaire. L’activité de 4E-BP1 et son état de phosphorylation, lorsqu’ils sont dérégulés, sont fréquemment étudiés en cancérologie, dans la signalisation métabolique et dans les réponses au stress, où le remodelage de la traduction contribue à des phénotypes associés aux maladies.

4E-BP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF4EBP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

4E-BP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF4EBP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF4EBP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de 4E-BP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF4EBP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de 4E-BP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie 4E-BP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF4EBP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.