Plasmide CRISPR d'Activation (h) 14-3-3 γ: sc-401063-ACT

YWHAG code la protéine adaptatrice humaine 14-3-3 gamma, un nœud d’interaction se liant aux phosphosérines/phosphothréonines qui module la stabilité, la localisation et l’activité de nombreux partenaires de signalisation. Par des interactions régulées avec des kinases, des phosphatases et des régulateurs transcriptionnels, 14-3-3 gamma contribue au contrôle du cycle cellulaire, à la signalisation apoptotique, à la régulation du métabolisme et à la dynamique du cytosquelette, en intégrant des signaux issus de voies telles que PI3K/AKT, MAPK et les cascades de réponse au stress. Une expression altérée de YWHAG ou un déséquilibre du réseau 14-3-3 a été associé à une prolifération déréglée, à des signaux de survie aberrants et à des dysfonctionnements neuronaux, ce qui en fait une cible pertinente pour des études en biologie du cancer et en neurobiologie. Son interactome étendu permet d’explorer les mécanismes de signalisation dépendants de la phosphorylation et la protéostase dans de multiples contextes cellulaires.

14-3-3 γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de YWHAG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

14-3-3 γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus YWHAG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription YWHAG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de 14-3-3 γ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus YWHAG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de 14-3-3 γ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie 14-3-3 γ dans les cellules tumorales présentant une expression de YWHAG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.