Plasmide CRISPR d'Activation (h) γPAK: sc-401595-ACT

PAK2 code la kinase sérine/thréonine humaine γPAK, un effecteur sensible à Rac1/Cdc42 qui coordonne le remodelage du cytosquelette d’actine, le renouvellement des adhérences focales et la motilité cellulaire directionnelle. γPAK intègre les signaux provenant des GTPases de la famille Rho afin de réguler des programmes transcriptionnels associés à la voie MAPK, la progression du cycle cellulaire et des voies de réponse au stress qui influencent l’apoptose et la survie. Par la phosphorylation de substrats en aval impliqués dans la dynamique du cytosquelette et les échafaudages de signalisation, PAK2 contribue à façonner des processus tels que la migration dépendante de l’adhérence et le trafic membranaire. Une activité ou une expression dérégulée de PAK2 a été associée à des phénotypes prolifératifs et invasifs altérés en cancérologie, ainsi qu’à des perturbations plus larges des réseaux de signalisation pertinentes dans des contextes inflammatoires et neurodéveloppementaux.

γPAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

γPAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de γPAK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de γPAK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie γPAK dans les cellules tumorales présentant une expression de PAK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.