Plasmide CRISPR d'Activation (m) γ-GCSm: sc-420574-ACT

Gclm code la sous-unité modulatrice de la glutamate‑cystéine ligase (γ‑GCSm), un composant clé de l’étape limitante de la biosynthèse du glutathion (GSH). En régulant l’efficacité catalytique et l’affinité pour les substrats du complexe γ‑glutamylcystéine ligase, γ‑GCSm contribue au maintien de l’équilibre rédox intracellulaire et soutient la détoxification des électrophiles et des espèces réactives de l’oxygène. L’activité de Gclm est liée à des réseaux de réponse au stress oxydant, notamment les programmes antioxydants dépendants de NRF2, l’homéostasie rédox mitochondriale et le métabolisme des xénobiotiques. Les altérations de la capacité Gclm/GSH sont largement utilisées pour modéliser la susceptibilité aux lésions oxydatives et des phénotypes associés au rédox, pertinents pour la neurodégénérescence, les dysfonctions métaboliques, l’inflammation et les réponses aux toxiques dans des systèmes murins.

γ-GCSm Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Gclm sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

γ-GCSm Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Gclm dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Gclm, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de γ-GCSm. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Gclm natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de γ-GCSm au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie γ-GCSm dans les cellules tumorales présentant une expression de Gclm silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.