Plasmide CRISPR d'Activation (h) βB2-crystallin: sc-403626-ACT

CRYBB2 code la βB2-cristalline, un composant structural majeur du cristallin de l’œil des vertébrés, qui contribue à l’assemblage des complexes de cristallines, au maintien de l’indice de réfraction et à la transparence du cristallin à long terme. Protéine fortement exprimée et exceptionnellement stable, la βB2-cristalline soutient la protéostasie des cellules des fibres du cristallin et aide à limiter l’agrégation protéique au cours de la maturation et du vieillissement. Une expression altérée de CRYBB2 ou un mauvais repliement des cristallines est associé à une architecture du cristallin perturbée et fait l’objet de nombreuses études dans le contexte de la cataractogenèse et d’autres phénotypes d’opacification du cristallin. Comme les cellules des fibres du cristallin sont pauvres en organites et dépendent de réseaux protéiques durables, CRYBB2 sert de modèle pour étudier les interactions avec les chaperonnes, les réponses au stress rédox et la stabilité des protéines dans des conditions de forte densité moléculaire.

βB2-crystallin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRYBB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

βB2-crystallin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRYBB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRYBB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de βB2-crystallin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRYBB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de βB2-crystallin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie βB2-crystallin dans les cellules tumorales présentant une expression de CRYBB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.