β2C Tubulin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400056-ACT

TUBB4B kodiert β2C-Tubulin, eine zentrale β-Tubulin-Isoform, die gemeinsam mit α-Tubulinen zu Mikrotubuli polymerisiert und so die Architektur des Zytoskeletts, den intrazellulären Transport und den Aufbau der mitotischen Spindel unterstützt. Die durch Tubulin-Heterodimere angetriebene Mikrotubuli-Dynamik reguliert den Zellzyklus, den Vesikeltransport und die Organisation neuronaler Fortsätze über Signalwege, an denen Motorproteine wie Kinesine und Dyneine beteiligt sind. Veränderte Expression von Tubulin-Isoformen und Mikrotubuli-Remodelling werden häufig im Zusammenhang mit chromosomaler Instabilität, gestörter Zellpolarität und Stressantworten untersucht, die mit einer onkogenen Transformation einhergehen. Da Mikrotubuli für Zellteilung und Migration zentral sind, ist TUBB4B breit relevant für die Forschung zur Regulation des Zytoskeletts, zur Differenzierung und zu durch die Mikroumgebung geprägten Phänotypen.

β2C Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TUBB4B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

β2C Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TUBB4B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TUBB4B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen β2C Tubulin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TUBB4B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von β2C Tubulin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des β2C Tubulin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TUBB4B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.