Plasmide CRISPR d'Activation (h) β1-Adaptin: sc-402948-ACT

AP1B1 code la β1‑adaptine, une sous-unité centrale du complexe protéique adaptateur 1 (AP‑1), qui couple la reconnaissance des cargos à la formation de vésicules médiée par la clathrine au niveau du réseau trans‑golgien et des endosomes. En se liant à des motifs de tri présents dans les protéines transmembranaires, AP‑1 coordonne le trafic polarisé, le recyclage endosomal et le maintien de la composition membranaire des cellules épithéliales et neuronales. La perturbation du transport dépendant d’AP‑1 dérègle la localisation des récepteurs et les sorties de signalisation, reliant le dysfonctionnement d’AP1B1 à des défauts de polarité cellulaire, à des processus neurodéveloppementaux et à l’homéostasie des protéines membranaires. En tant que nœud central du trafic intracellulaire, la β1‑adaptine est fréquemment étudiée dans le contexte de la dynamique endosome–Golgi, de la fidélité du tri des cargos et de la communication entre organites.

β1-Adaptin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AP1B1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β1-Adaptin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AP1B1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AP1B1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β1-Adaptin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AP1B1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β1-Adaptin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β1-Adaptin dans les cellules tumorales présentant une expression de AP1B1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.