Plasmide CRISPR d'Activation (h) β-1,3-Gal-T5: sc-409777-ACT

B3GALT5 code la β-1,3-Gal-T5, une β1,3-galactosyltransférase résidente de l’appareil de Golgi qui contribue à la synthèse et à l’allongement des glycolipides et des glycoprotéines en ajoutant un galactose en liaison β1,3 à des accepteurs contenant de la N‑acétylglucosamine. Par son rôle dans la glycosylation, la β-1,3-Gal-T5 influence la composition des glycannes à la surface cellulaire, laquelle gouverne le trafic des protéines, l’organisation des récepteurs et les interactions cellule–cellule médiées par les lectines. Une activité altérée de B3GALT5 peut modifier des programmes de signalisation et d’adhésion dépendants des glycannes, impliqués dans la reconnaissance immunitaire, la différenciation épithéliale et des phénotypes de glycosylation associés aux tumeurs. Ainsi, B3GALT5 constitue une cible utile pour analyser comment les réseaux de glycosyltransférases régulent la biologie membranaire et des changements de comportement cellulaire pertinents pour les maladies.

β-1,3-Gal-T5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de B3GALT5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β-1,3-Gal-T5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus B3GALT5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription B3GALT5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β-1,3-Gal-T5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus B3GALT5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β-1,3-Gal-T5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β-1,3-Gal-T5 dans les cellules tumorales présentant une expression de B3GALT5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.