Plásmido CRISPR de Activación (h) α-SNAP: sc-403996-ACT

NAPA codifica la α-SNAP humana, una proteína soluble de unión a NSF que se une a los complejos SNARE y coopera con NSF para impulsar el desensamblaje de SNARE dependiente de ATP, lo que permite rondas repetidas de acoplamiento de vesículas y fusión de membranas. Mediante esta función tipo chaperona, α-SNAP sostiene la exocitosis constitutiva y regulada, la endocitosis y el transporte del Golgi al RE, influyendo así en la secreción, el reciclaje de receptores y la homeostasis de los orgánulos. La alteración del ciclado de SNARE dependiente de NAPA puede perturbar la proteostasis y la dinámica de membranas, procesos que se intersectan con la función sináptica y las respuestas al estrés. El tráfico vesicular desregulado y el recambio de complejos SNARE están implicados en mecanismos de enfermedades neurodegenerativas y del neurodesarrollo, lo que convierte a α-SNAP en un nodo útil para estudios de transporte intracelular centrados en vías.

α-SNAP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NAPA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

α-SNAP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NAPA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NAPA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de α-SNAP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NAPA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de α-SNAP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía α-SNAP en células tumorales con expresión de NAPA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.