Plasmide CRISPR d'Activation (h) αPAK: sc-400857-ACT

PAK1 code pour l’αPAK (p21‑activated kinase 1), une kinase sérine/thréonine activée en aval des GTPases de la famille Rho RAC1 et CDC42. L’αPAK intègre des signaux provenant des récepteurs aux facteurs de croissance et des intégrines afin de réguler le remodelage du cytosquelette d’actine, le renouvellement des adhésions focales et la motilité cellulaire, tout en modulant également les sorties des voies MAPK/ERK et PI3K‑AKT. Par la phosphorylation de substrats impliqués dans la dynamique du cytosquelette et la régulation transcriptionnelle, PAK1 influence la prolifération, la survie et les réponses au stress dans de nombreux types cellulaires. Une signalisation PAK1 dérégulée a été associée à des programmes aberrants de migration et de prolifération et est fréquemment étudiée dans le contexte de la biologie du cancer, des neurosciences et des réseaux de signalisation inflammatoire.

αPAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

αPAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de αPAK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de αPAK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie αPAK dans les cellules tumorales présentant une expression de PAK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.