ZO-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400196-ACT

Das humane Gen **TJP1** kodiert **Zonula occludens-1 (ZO-1)**, ein multidomaines Scaffold-Protein, das Tight-Junction-Komplexe organisiert, indem es **Claudine** und **Occludin** über PDZ-vermittelte Interaktionen mit dem kortikalen Aktin-Zytoskelett verknüpft. ZO-1 koordiniert die Ausbildung epithelialer und endothelialer Barrieren, die apiko-basale Polarität sowie die mechanotransduktive Signalübertragung an Zellkontakten und integriert Signale, die das Zytoskelett-Remodeling und die kontaktabhängige Wachstumskontrolle beeinflussen. Über diese Funktionen trägt TJP1/ZO-1 zur Regulation der parazellulären Permeabilität und von Zellmigrationsprogrammen bei, die für Prozesse wie epithelial-mesenchymale Transitionen und Gewebe-Remodeling relevant sind. Eine dysregulierte ZO-1-Lokalisation oder -Expression wird häufig in der barriereassoziierten Pathobiologie untersucht, einschließlich entzündungsbedingter Permeabilitätsveränderungen und Tumorprogressions-Phänotypen in unterschiedlichen epithelialen Kontexten.

ZO-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TJP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ZO-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TJP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TJP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ZO-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TJP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ZO-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ZO-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TJP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.