Zic2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404720-ACT

ZIC2 kodiert den Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Zic2, einen zentralen Regulator der frühen embryonalen Musterbildung und neuroentwicklungsbezogener Genprogramme. Zic2 bindet an cis-regulatorische Elemente, um transkriptionelle Netzwerke zu steuern, die an der Bildung des Neuralrohrs, der Spezifizierung des Vorderhirns und der Bestimmung von Zellschicksalen beteiligt sind, und greift dabei in Signalwege ein, die Morphogenantworten und Übergänge des Chromatinzustands prägen. Eine fehlregulierte ZIC2-Expression oder -Funktion wurde mit Entwicklungsstörungen wie der Holoprosenzephalie in Verbindung gebracht, und veränderte, ZIC2 betreffende transkriptionelle Schaltkreise wurden in mehreren Krebs-Kontexten beschrieben. Als DNA-bindender Regulator stellt Zic2 einen gut untersuchbaren Knotenpunkt dar, um Genregulationsnetzwerke, Linienspezifizierung und transkriptionsfaktorgetriebene Phänotypen in humanen Zellmodellen zu analysieren.

Zic2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZIC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Zic2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZIC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZIC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Zic2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZIC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Zic2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Zic2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZIC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.