Wnt-4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423717-ACT

Mouse Wnt4 kodiert Wnt-4, einen sezernierten glycoproteinhaltigen Liganden, der über die WNT-Signalübertragung Entscheidungen zum Zellschicksal, die Morphogenese und die Gewebemusterbildung reguliert. Wnt-4 kann Frizzled/LRP-Rezeptorkomplexe binden und dadurch sowohl die kanonische, β‑Catenin‑abhängige Transkription als auch nicht-kanonische Signalwege modulieren, die Polarität, Migration und die Dynamik des Zytoskeletts beeinflussen. Während der Entwicklung und bei der Homöostase adulter Gewebe trägt Wnt-4 zu Organogenese- und Differenzierungsprogrammen bei; eine fehlregulierte WNT4-Signalisierung wird in verschiedenen Kontexten mit kongenitalen urogenitalen Phänotypen, aberranten Epithel‑Stroma‑Interaktionen und einer onkogenen Umverdrahtung von Signalwegen in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen Wnt4 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um das Crosstalk mit TGF‑β-, Notch- und MAPK-Signalwegen zu untersuchen und transkriptionelle Programme nachgeschaltet zur WNT-Aktivierung zu analysieren.

Wnt-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Wnt4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wnt-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Wnt4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Wnt4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wnt-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Wnt4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wnt-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wnt-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Wnt4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.