Plasmide CRISPR d'Activation (m2) Wnt-10b: sc-423710-ACT-2

Le gène murin Wnt10b code la glycoprotéine sécrétée Wnt-10b, un ligand canonique de la voie Wnt qui active les complexes récepteurs Frizzled/LRP afin de favoriser la stabilisation de la β-caténine et la transcription dépendante de TCF/LEF. Wnt-10b régule la mise en place des patrons embryonnaires et l’homéostasie des tissus adultes en contrôlant les décisions de destinée cellulaire, la prolifération et la différenciation, avec des rôles bien établis dans l’ostéoblastogenèse, la suppression de l’adipogenèse ainsi que la biologie des follicules pileux et de la glande mammaire. Une signalisation Wnt10b dérégulée a été associée à des modifications de la masse osseuse, à des phénotypes métaboliques et du tissu adipeux, ainsi qu’à une activation de la voie Wnt liée aux tumeurs dépendante du contexte, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques de la dynamique Wnt/β-caténine. L’édition génétique de Wnt10b dans des cellules ou des modèles murins permet de disséquer fonctionnellement une signalisation Wnt spécifique d’un ligand, les interactions entre voies, et des phénotypes développementaux ou métaboliques à l’aide d’essais rapporteurs, de systèmes de différenciation et d’analyses de lignage in vivo.

Wnt-10b Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Wnt10b sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Wnt-10b Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Wnt10b dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Wnt10b, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Wnt-10b. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Wnt10b natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Wnt-10b au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Wnt-10b dans les cellules tumorales présentant une expression de Wnt10b silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.