Plasmide CRISPR d'Activation (m) WAPL: sc-432331-ACT

La WAPL murine (Wapl) code un facteur de libération de la cohésine qui régule l’association dynamique de la cohésine à la chromatine, façonnant l’organisation du génome à un niveau supérieur ainsi que la cohésion des chromatides sœurs. En favorisant le déchargement de la cohésine pendant l’interphase et la progression mitotique, WAPL influence le calendrier de réplication de l’ADN, la régulation transcriptionnelle et la ségrégation fidèle des chromosomes. L’activité de WAPL s’articule avec les processus de réponse aux dommages de l’ADN et de réparation en modulant la stabilisation, dépendante de la cohésine, des fourches de réplication bloquées et des foyers de réparation. Une dynamique de cohésine dérégulée et une expression altérée de WAPL ont été associées à l’instabilité génomique et à des phénotypes liés aux cohésinopathies, faisant de Wapl un nœud utile pour étudier l’architecture de la chromatine et le contrôle du cycle cellulaire dans des modèles pertinents pour les maladies.

WAPL Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Wapl sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

WAPL Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Wapl dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Wapl, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de WAPL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Wapl natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de WAPL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie WAPL dans les cellules tumorales présentant une expression de Wapl silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.