VRL-1 Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h2): sc-401648-KO-2

Visão geral

O TRPV2 (VRL-1) humano codifica um canal de cátions não seletivo, permeável a Ca2+, da família dos receptores de potencial transitório (TRP), que funciona como um sensor polimodal, respondendo a estímulos mecânicos e químicos e contribuindo para a termossensação. O influxo de cálcio mediado por VRL-1 acopla a estimulação da membrana à sinalização intracelular, incluindo a atividade de quinases dependentes de Ca2+ e programas transcricionais a jusante que regulam a dinâmica do citoesqueleto, o tráfego vesicular e a sinalização inflamatória. A atividade do TRPV2 tem sido associada a processos como a ativação de macrófagos e a fagocitose, bem como a respostas ao estresse celular e à remodelação tecidual. Alterações na sinalização e na expressão de TRPV2 foram relatadas em contextos como a biologia da dor neuropática, a fisiologia de cardiomiócitos e a migração de células tumorais, sustentando seu uso como alvo mecanístico em diversos modelos relevantes para doenças.

O VRL-1 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h2) é um conjunto de plasmídeos concebido para a interrupção direcionada do gene TRPV2 em human linhas celulares. Cada plasmídeo do conjunto coexpressa um sgRNA único, direcionado a um local distinto dentro do locus TRPV2, juntamente com a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, e codifica GFP para permitir a identificação fluorescente e o enriquecimento das células transfectadas com sucesso. Esta estratégia multiguia aumenta a probabilidade de induzir deslocamentos de quadro de leitura ou deleções que produzam um knockout funcional, oferecendo uma alternativa mais robusta às abordagens de guia único. As DSBs induzidas em múltiplos locais são resolvidas através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou, quando utilizadas com o modelo doador HDR incluído, através da reparação dirigida por homologia (HDR) num local-alvo definido dentro do locus.

Quando utilizado em conjunto com o doador HDR que expressa RFP, a fluorescência de GFP e RFP pode ser utilizada em conjunto para distinguir populações de células transfectadas das editadas, simplificando os fluxos de trabalho de triagem e seleção de clones baseados em citometria de fluxo.

Doador de Reparação Dirigida por Homologia (HDR) — Cassete de Puromicina com Repórter RFP

Para aplicações que requerem clones knockout confirmados e selecionáveis, o VRL-1 Plasmídeo HDR (h2) inclui uma construção doadora HDR contendo uma cassete de resistência à puromicina (PuroR) e um repórter de proteína fluorescente vermelha (RFP), flanqueados por braços de homologia específicos para um local-alvo definido TRPV2.
Quando co-transfectado com o VRL-1 Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h2):

• A cassete PuroR-RFP integra-se no local de corte da Cas9 através de HDR, interrompendo o quadro de leitura aberto TRPV2.
  A fluorescência da RFP fornece um indicador visual imediato do sucesso da integração, permitindo a identificação ou triagem baseada na fluorescência das células editadas antes ou em paralelo com a seleção por puromicina.
  As células editadas com sucesso são confirmadas através da resistência à puromicina, reduzindo substancialmente a carga de triagem de clones.
  Esta estratégia de seleção é ideal para gerar linhas celulares KO clonais estáveis para estudos funcionais a jusante, triagem de fármacos ou desenvolvimento de modelos.

Sistema de remoção de cassete Cre-lox

A construção doadora HDR apresenta sítios loxP flanqueando a cassete de seleção PuroR-RFP para permitir a remoção limpa do marcador após a confirmação do clone. A expressão transitória da recombinase Cre através do Vetor Cre: sc-418923 incluído excisa a cassete, deixando um local loxP residual mínimo dentro do locus TRPV2 e eliminando potenciais efeitos de confusão em ensaios a jusante.
Esta abordagem em duas etapas:

• Minimiza a perturbação da arquitetura local da cromatina e dos elementos reguladores vizinhos
  Restaura um contexto genómico quase nativo no locus editado
  Permite a reutilização da estratégia de seleção com puromicina na mesma linha celular para edições adicionais

Características principais

• gRNA direcionado para o(s) exão(ões) TRPV2 crítico(s) para a função VRL-1
  Coexpressão de SpCas9 e sgRNA a partir de um único plasmídeo para uma entrega simplificada
  Doador HDR com resistência à puromicina para seleção positiva de clones
  Cassete PuroR flanqueada por loxP com vetor de recombinase Cre para remoção contínua do marcador
  Fornecido pronto a usar para entrega por transfecção

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.