Plásmido CRISPR de Activación (h) VPS4A: sc-402005-ACT

El VPS4A humano codifica una ATPasa AAA+ que impulsa el desensamblaje y el reciclaje de ESCRT-III, lo que permite los eventos de remodelación de membranas necesarios para la biogénesis de cuerpos multivesiculares, la clasificación de carga endosomal, la abscisión citocinética y la reparación de la membrana plasmática. La actividad de VPS4A se coordina con componentes de ESCRT para regular la disminución de receptores, la biogénesis de exosomas y microvesículas, y el sellado de la envoltura nuclear tras la mitosis. Debido a su papel central en el tráfico endolisosomal y la fisión de membranas, VPS4A se estudia con frecuencia en vías que afectan a la proteostasis, la señalización inmunitaria innata y la gemación viral que secuestra la maquinaria ESCRT. La desregulación de las funciones de ESCRT/VPS4 se ha vinculado con fenotipos neurodegenerativos, alteraciones en la señalización de factores de crecimiento y cambios asociados al cáncer en el tráfico vesicular y la división celular.

VPS4A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VPS4A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VPS4A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VPS4A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VPS4A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VPS4A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VPS4A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VPS4A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VPS4A en células tumorales con expresión de VPS4A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.