VPS45 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-411599-ACT

VPS45 codifica um regulador conservado da família Sec1/Munc18 do tráfego vesicular, que coordena eventos de fusão de membranas dependentes de SNARE, necessários para o transporte de endossomos para o Golgi e para a maturação endossomal. Em células humanas, o VPS45 sustenta a estabilidade e a função da maquinaria de ancoragem relacionada a HOPS/CORVET e ajuda a manter a triagem de cargas, a reciclagem de receptores e o tráfego direcionado aos lisossomos. A disrupção do tráfego dependente de VPS45 perturba a homeostase de organelas, afeta as vias de autofagia–lisossomo e pode alterar a saída de sinalização ao modificar a disponibilidade de receptores na membrana plasmática. Estudos genéticos e funcionais relacionam a disfunção de VPS45 a fenótipos imunológicos e hematopoéticos, tornando-o relevante para pesquisas mecanísticas sobre defeitos no transporte intracelular e suas consequências celulares a jusante.

VPS45 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS45 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS45 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS45 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS45, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS45. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS45 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS45 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS45 em células tumorais com expressão de VPS45 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.