Plásmido CRISPR de Activación (h) VPS45: sc-411599-ACT

VPS45 codifica un regulador conservado de la familia Sec1/Munc18 del tráfico vesicular que coordina los eventos de fusión de membranas dependientes de SNARE necesarios para el transporte de endosoma a Golgi y la maduración endosomal. En células humanas, VPS45 contribuye a la estabilidad y función de la maquinaria de anclaje relacionada con HOPS/CORVET y ayuda a mantener la clasificación de carga, el reciclaje de receptores y el tráfico dirigido a lisosomas. La alteración del tráfico dependiente de VPS45 perturba la homeostasis de los orgánulos, afecta las vías de autofagia–lisosoma y puede modificar la salida de señalización al cambiar la disponibilidad de receptores en la membrana plasmática. Estudios genéticos y funcionales vinculan la disfunción de VPS45 con fenotipos inmunitarios y hematopoyéticos, lo que la hace relevante para la investigación mecanística de defectos en el transporte intracelular y sus consecuencias celulares posteriores.

VPS45 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VPS45 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VPS45 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VPS45 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VPS45, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VPS45. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VPS45 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VPS45 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VPS45 en células tumorales con expresión de VPS45 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.