Plásmido CRISPR de Activación (h) VPS26B: sc-410249-ACT

VPS26B codifica un componente central del complejo retromer, que regula la clasificación y el reciclaje de la carga endosomal desde los endosomas hacia la red trans-Golgi y la membrana plasmática. En coordinación con VPS35 y VPS29, VPS26B ayuda a mantener la homeostasis de las proteínas de membrana, regula el tráfico de receptores y respalda la función lisosomal al limitar la maduración aberrante de los endosomas. Las vías dependientes del retromer influyen en la señalización celular, la localización de transportadores de nutrientes y la proteostasis intracelular, vinculando la actividad de VPS26B con procesos más amplios como la autofagia y las respuestas al estrés endolisosomal. La desregulación del tráfico endosomal y de la función del retromer se ha implicado en fenotipos neurodegenerativos y del desarrollo, lo que convierte a VPS26B en un objetivo relevante para estudios mecanísticos sobre la biología de enfermedades asociadas al tráfico de membranas.

VPS26B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VPS26B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VPS26B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VPS26B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VPS26B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VPS26B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VPS26B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VPS26B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VPS26B en células tumorales con expresión de VPS26B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.