Plásmido CRISPR de Activación (h) vinculin: sc-400227-ACT

El VCL humano codifica la vinculina, un adaptador mecanosensible de unión a actina enriquecido en adhesiones focales y uniones adherentes, donde acopla los complejos de integrinas y cadherinas al citoesqueleto de actina. La vinculina regula la dinámica de la adhesión célula–MEC y célula–célula, la transmisión de fuerzas y la remodelación del citoesqueleto mediante vías que implican talina, paxilina, la señalización FAK/Src y las GTPasas de la familia Rho. Al ajustar el recambio de adhesiones y las fuerzas de tracción, VCL influye en la migración, la polaridad y la morfogénesis tisular, y su desregulación se estudia en contextos de invasividad alterada y potencial metastásico. La mecanotransducción dependiente de VCL también es relevante en modelos de adhesión de cardiomiocitos y acoplamiento contráctil, donde los cambios en la integridad de las uniones pueden afectar las respuestas al estrés.

vinculin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VCL sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

vinculin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VCL en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VCL, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de vinculin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VCL y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de vinculin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía vinculin en células tumorales con expresión de VCL silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.