Plásmido CRISPR de Activación (h) V-ATPase G1: sc-406125-ACT

ATP6V1G1 codifica la subunidad G1 del dominio periférico V1 de la H+-ATPasa vacuolar (V-ATPasa), una bomba de protones multisubunidad que acopla la hidrólisis de ATP a la acidificación de los orgánulos. El control del pH impulsado por la V-ATPasa es fundamental para la maduración de endosomas y lisosomas, la endocitosis mediada por receptores, el flujo autofágico y el tráfico vesicular, e influye en redes de señalización como mTORC1 a través de la detección lisosomal de nutrientes. Al modular la acidez luminal, la actividad de la V-ATPasa afecta a la activación de proteasas, el procesamiento de antígenos y la dinámica de fusión de membranas en los distintos compartimentos intracelulares. La desregulación de la homeostasis del pH de los orgánulos y el desequilibrio de subunidades de la V-ATPasa se han vinculado a alteraciones metabólicas, fenotipos invasivos y programas de adaptación al estrés observados en múltiples contextos celulares relevantes para enfermedades.

V-ATPase G1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP6V1G1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

V-ATPase G1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP6V1G1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP6V1G1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de V-ATPase G1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP6V1G1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de V-ATPase G1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía V-ATPase G1 en células tumorales con expresión de ATP6V1G1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.