Plásmido CRISPR de Activación (h) V-ATPase D: sc-403291-ACT

ATP6V1D codifica la subunidad D de la H+-ATPasa vacuolar (V-ATPasa) del dominio V1, una ATPasa rotatoria que acopla la hidrólisis de ATP al bombeo de protones a través de membranas intracelulares. Al sostener la acidificación de los orgánulos, la subunidad D de la V-ATPasa contribuye a la maduración del endosoma al lisosoma, el flujo autofágico, el reciclaje de receptores y el tráfico dependiente del pH a través de las vías secretora y endocítica. El control del pH dependiente de la V-ATPasa también influye en la detección de nutrientes, incluida la señalización de mTORC1 en la superficie lisosomal, y modula la actividad de proteasas dentro de compartimentos ácidos. La disfunción de la V-ATPasa y la acidificación vesicular desregulada se han asociado con alteraciones de la proteostasis, procesos neurodegenerativos y fenotipos metabólicos e invasivos ligados al cáncer, lo que convierte a ATP6V1D en un nodo útil para estudios mecanísticos de la homeostasis celular.

V-ATPase D El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP6V1D sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

V-ATPase D El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP6V1D en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP6V1D, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de V-ATPase D. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP6V1D y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de V-ATPase D en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía V-ATPase D en células tumorales con expresión de ATP6V1D silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.