V-ATPase B2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401896-ACT

ATP6V1B2 kodiert die B2‑Untereinheit der peripheren V1‑Domäne der vakuolären H+-ATPase (V‑ATPase), einer aus mehreren Untereinheiten bestehenden Protonenpumpe, die durch ATP‑Hydrolyse Endosomen, Lysosomen und andere intrazelluläre Kompartimente ansäuert. Diese Ansäuerung von Organellen ist essenziell für die rezeptorvermittelte Endozytose, den autophagischen Flux, die Aktivierung lysosomaler Enzyme und den vesikulären Transport; zudem beeinflusst sie indirekt die Nährstoffsensorik und die mTOR‑gekoppelte metabolische Anpassung. Durch die Regulation des luminalen pH-Werts wirkt sich die V‑ATPase‑Aktivität auf Proteinprozessierung und -turnover, Antigenprozessierung sowie das Recycling von Membranproteinen aus. Fehlregulierte Wege der Vesikel‑ und Lysosomenansäuerung unter Beteiligung von V‑ATPase‑Komponenten wurden mit neuroentwicklungsbedingten und neurologischen Phänotypen sowie allgemeineren Störungen des intrazellulären Transports in Verbindung gebracht, wodurch ATP6V1B2 ein hilfreicher Knotenpunkt für die Untersuchung von Proteostase und endolysosomaler Dysfunktion ist.

V-ATPase B2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP6V1B2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

V-ATPase B2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP6V1B2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP6V1B2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen V-ATPase B2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP6V1B2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von V-ATPase B2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des V-ATPase B2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP6V1B2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.