Plasmide CRISPR d'Activation (h) V-ATPase A1: sc-400975-ACT

ATP6V0A1 code l’isoforme a1 de la sous-unité a du secteur V0 de la H+-ATPase vacuolaire (V-ATPase), une pompe à protons multisous-unités qui acidifie les endosomes, les lysosomes et les vésicules sécrétoires. En favorisant l’acidification des organites, la V-ATPase A1 régule l’endocytose médiée par les récepteurs, le flux autophagique, la protéolyse lysosomale, le trafic vésiculaire et les voies de détection des nutriments liées à la signalisation mTOR. Une activité correcte de la V-ATPase est nécessaire au tri des protéines dépendant du pH ainsi qu’aux événements de fusion membranaire qui façonnent le cycle des vésicules synaptiques et, plus largement, la protéostasie. La dérégulation de l’acidification des vésicules et des lysosomes associée à une perturbation d’ATP6V0A1 est pertinente pour les études sur la neurodégénérescence, les phénotypes du développement et les réponses au stress cellulaire induites par une capacité dégradative altérée.

V-ATPase A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6V0A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

V-ATPase A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6V0A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6V0A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de V-ATPase A1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6V0A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de V-ATPase A1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie V-ATPase A1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6V0A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.