USP9X CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402285-ACT

USP9X (Ubiquitin-spezifische Peptidase 9, X-chromosomal) ist ein deubiquitinierendes Enzym, das die Proteinstabilität und die Signalweiterleitung reguliert, indem es Ubiquitin-Ketten von Substratproteinen entfernt. Es beeinflusst die Proteostase, den endozytotischen Transport und Stressantwort-Signalwege und wurde mit der Modulation von Apoptose, Zellzyklus-Kontrolle und DNA-Schadensantworten in Verbindung gebracht – durch kontextabhängige Stabilisierung zentraler Signalkomponenten. Die USP9X-Aktivität greift in Netzwerke des Ubiquitin–Proteasom-Systems und der Autophagie ein und prägt damit zelluläre Differenzierung sowie Entscheidungen über das Überleben von Zellen. Eine dysregulierte Expression oder Funktion von USP9X wurde mit mehreren Krebserkrankungen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen assoziiert, was es zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien der Ubiquitin-Signalgebung in menschlichen Zellen macht.

USP9X Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen USP9X-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

USP9X Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des USP9X-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der USP9X-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen USP9X-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native USP9X-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von USP9X-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des USP9X-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem USP9X-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.