URB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408597-ACT

CCDC80 kodiert URB, ein mit der extrazellulären Matrix assoziiertes und sezerniertes Protein, das an Stromaremodellierung, Zell–Matrix-Adhäsion und der Regulation der Wachstumsfaktorsignalübertragung beteiligt ist. URB wurde mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die die Adipogenese, die metabolische Homöostase sowie die kontextabhängige Kontrolle von Zellproliferation und -migration beeinflussen, was zu einer Rolle bei der Gewebeorganisation und dem mesenchymal–epithelialen Crosstalk passt. Eine veränderte CCDC80-Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, darunter adipositasassoziierte Phänotypen und Krebserkrankungen, bei denen sie mit Veränderungen der Zusammensetzung des Tumormikromilieus und des invasiven Verhaltens korrelieren kann. Diese Eigenschaften machen CCDC80 zu einem nützlichen Ziel für die Analyse extrazellulärer Signalnetzwerke, der Matrixbiologie und transkriptioneller Programme, die mit Phänotypwechseln einhergehen.

URB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCDC80-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

URB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCDC80-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCDC80-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen URB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCDC80-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von URB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des URB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCDC80-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.