Plasmide CRISPR d'Activation (h) UPIIIa: sc-401796-ACT

UPK3A code l’uroplakine IIIa (UPIIIa), une protéine membranaire de type tétraspanine qui s’assemble avec d’autres uroplakines pour former des plaques cristallines à la surface apicale des cellules « parapluie » de l’urothélium. Ces plaques sont essentielles à la différenciation terminale de l’urothélium et contribuent à l’intégrité de la barrière épithéliale ainsi qu’à la stabilité mécanochimique lors du remplissage et de la miction vésicaux. UPIIIa participe à l’organisation de la membrane urothéliale et au trafic vésiculaire associé à l’acheminement des plaques vers la surface cellulaire, reliant les programmes de différenciation à la biogenèse spécialisée de la membrane apicale. Des profils d’expression altérés des uroplakines sont utilisés pour étudier le remodelage urothélial et les changements d’état de lignée dans des contextes tels que les réponses à des lésions de l’épithélium vésical et la biologie du carcinome urothélial.

UPIIIa Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UPK3A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UPIIIa Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UPK3A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UPK3A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UPIIIa. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UPK3A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UPIIIa au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UPIIIa dans les cellules tumorales présentant une expression de UPK3A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.