Plásmido CRISPR de Activación (h) UPF0493: sc-405363-ACT

EPG5 codifica UPF0493, una gran proteína de tipo coiled-coil que actúa como regulador clave de la autofagia al coordinar las etapas tardías de la maduración del autofagosoma y la fusión autofagosoma–lisosoma. A través de su papel en el flujo autofágico, EPG5 influye en la proteostasis, el recambio de orgánulos y las respuestas celulares al estrés, que interactúan con las vías de tráfico lisosomal y del sistema endomembranoso. La alteración de la autofagia dependiente de EPG5 se ha relacionado con una eliminación deficiente de agregados proteicos y orgánulos dañados, procesos especialmente importantes para la homeostasis neuronal. Como resultado, EPG5/UPF0493 se estudia con frecuencia en el contexto de fenotipos del neurodesarrollo y neurodegenerativos, así como de mecanismos más amplios de disfunción lisosomal.

UPF0493 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EPG5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UPF0493 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EPG5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EPG5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UPF0493. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EPG5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UPF0493 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UPF0493 en células tumorales con expresión de EPG5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.