UFM1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416900-ACT

Das humane UFM1 kodiert Ubiquitin-Fold Modifier 1, ein ubiquitinähnliches Protein, das über die UFMylierungs-Kaskade unter Beteiligung von UBA5, UFC1 und UFL1 an Substrate konjugiert wird. Diese posttranslationale Modifikation reguliert die Proteostase des endoplasmatischen Retikulums, die ribosomenassoziierte Qualitätskontrolle sowie zelluläre Antworten auf proteotoxischen und oxidativen Stress und steht in etabliertem Zusammenhang mit der ER-Homöostase und der Funktion des sekretorischen Wegs. UFM1-abhängige Signalgebung wurde mit neurodevelopmentalen und hämatologischen Phänotypen in Verbindung gebracht, und eine veränderte UFMylierungsaktivität wird im Kontext von Überleben und Stressanpassung von Krebszellen untersucht. Als zentraler Modifikator in diesem Signalweg dient UFM1 als nützlicher Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie ubiquitinähnliche Konjugation Proteinumsatz, Translationskontrolle und Stressantworten von Organellen feinabstimmt.

UFM1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UFM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UFM1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UFM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UFM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UFM1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UFM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UFM1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UFM1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UFM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.